作為人類(lèi)所需的食物、藥物、衣物和燃料，千百年來(lái)，植物在我們的日常生活中扮演著關(guān)鍵角色。如今，隨著分子技術(shù)的發(fā)展，全世界越來(lái)越多的科學(xué)家們將關(guān)注的焦點(diǎn)放在研究植物遺傳的多樣性和育種培養(yǎng)上。

根據(jù)最新估計(jì)，目前科學(xué)界已知植物的物種大約有40萬(wàn)種，但迄今為止，科學(xué)界只測(cè)序了約600株植物品系（約225種種類(lèi)）的基因組。既然植物研究在我們的生活中扮演著如此重要的角色，為何只有這么少的種類(lèi)得到了測(cè)序？究其原因，與植物基因組大小多樣和復(fù)雜程度不無(wú)關(guān)系。

   基因組大小多樣化  

植物基因組的大小非常多樣，從61Mb的螺旋貍藻 (Genlisea tuberosa)到152Gb的重樓百合(Paris japonica)，后者幾乎是人類(lèi)基因組的50倍。此外，植物還表現(xiàn)出多種倍性（染色體拷貝），從二倍體——兩個(gè)拷貝，如擬南芥（Arabidopsis thaliana），到十倍體——十個(gè)拷貝，如草莓（Fragaria iturupensis）。由于傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)技術(shù)通常產(chǎn)生150~300bp的讀長(zhǎng)長(zhǎng)度，這種大型基因組在本質(zhì)上難以使用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。

   重復(fù)區(qū)域和結(jié)構(gòu)變異  

植物還可以表現(xiàn)出具有高比例重復(fù)DNA的超大基因組。一些物種（例如玉米）呈現(xiàn)出超過(guò)80％的重復(fù)DNA，這些DNA重復(fù)序列可以復(fù)制并插入新的染色體位置，因而在基因組進(jìn)化中發(fā)揮重要作用。也正是如此，準(zhǔn)確定位和表征這些轉(zhuǎn)座因子可以為植物進(jìn)化和適應(yīng)提供新的信息，對(duì)遺傳操作具有重要作用。

當(dāng)前的短讀長(zhǎng)測(cè)序方法，由于讀長(zhǎng)長(zhǎng)度無(wú)法跨越完整的DNA重復(fù)區(qū)域，由其產(chǎn)生的大多數(shù)現(xiàn)有基因組組裝均顯示對(duì)應(yīng)重復(fù)區(qū)域和結(jié)構(gòu)變異存在著許多不完整的間隙。

   植物本身的問(wèn)題  

由于高水平的次級(jí)代謝物如多糖和多酚，想要從植物細(xì)胞中獲得純的、高質(zhì)量的高分子量DNA相當(dāng)困難。這些污染物的存在是導(dǎo)致低測(cè)序產(chǎn)率的最常見(jiàn)原因之一，并且會(huì)對(duì)下游分析產(chǎn)生很大影響。目前并沒(méi)有一種通用的涵蓋所有植物物種、組織、或在不同條件下都能使用的實(shí)驗(yàn)方案。科學(xué)家們往往需要多次測(cè)序樣本來(lái)進(jìn)行測(cè)試，不斷優(yōu)化和調(diào)整方案，這也導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)成本的提高。

   納米孔測(cè)序技術(shù)  

為了解決這些問(wèn)題，生成高質(zhì)量、高度連續(xù)的植物基因組，為植物保護(hù)和育種提供新的機(jī)會(huì)，科學(xué)家們將目光轉(zhuǎn)向了更新一代的測(cè)序方法——納米孔測(cè)序。納米孔測(cè)序由英國(guó)公司Oxford Nanopore Technologies研發(fā)，其提供的長(zhǎng)讀長(zhǎng)能夠跨越高度重復(fù)和含有結(jié)構(gòu)變異的區(qū)域，提供更連續(xù)的基因組組裝[1]。納米孔能夠測(cè)序處理呈現(xiàn)給它的DNA片段的整個(gè)長(zhǎng)度，并且已經(jīng)可以做到常規(guī)處理數(shù)千kb的完整片段，目前為止最長(zhǎng)的單一讀長(zhǎng)超過(guò)了2 Mb[2]。這種超長(zhǎng)讀長(zhǎng)無(wú)疑能夠簡(jiǎn)化基因組的組裝過(guò)程，提供更完整、更連續(xù)的基因組。因此，研究人員現(xiàn)在正在使用納米孔技術(shù)對(duì)植物參考基因組進(jìn)行從頭測(cè)序和分析。

眾所周知，郁金香是荷蘭的代名詞，每年的出口量為20億株。因此，理解郁金香的基因組，提高育種和養(yǎng)殖對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)有著巨大的影響。然而，郁金香的基因組非常的龐大。它大小約為34 Gb，是人類(lèi)基因組的10倍，并且包含大量的重復(fù)區(qū)域，對(duì)傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)測(cè)序和組裝可以說(shuō)是巨大的挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對(duì)這個(gè)挑戰(zhàn)，荷蘭Future Genomics Technologies的Jansen博士轉(zhuǎn)向了納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)技術(shù)，帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)利用Oxford Nanopore Technologies研發(fā)的測(cè)序儀MinION和PromethION對(duì)郁金香基因組（Tulipa gesneriana）進(jìn)行測(cè)序[3]。他們總共生成了203 Gb的數(shù)據(jù)，約為6倍的基因組覆蓋率。在完成測(cè)序后，他們面臨的又一挑戰(zhàn)是將這些序列重新組裝成基因組。傳統(tǒng)的基因組組裝工具需要將每一條讀長(zhǎng)與其它所有讀長(zhǎng)比對(duì)，在大型基因組的組裝中，這不但增加了計(jì)算量，也大大延長(zhǎng)了電腦CPU的耗時(shí)。研究小組為此研發(fā)了一種名為“Tulipa-julia”的組裝工具，只利用納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)上獨(dú)特的、以及含有信息量的部分來(lái)進(jìn)行比對(duì)。由于基因組龐大，目前比對(duì)工作仍在進(jìn)行中。但Jansen博士表示，他們初步獲得的結(jié)果已證明納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)在大基因組測(cè)序中的價(jià)值。并且，高通量測(cè)序設(shè)備PromethION能夠穩(wěn)定地產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，使他們能夠更輕易地測(cè)序任何基因組。

在20世紀(jì)50年代，Barbara McClintock首次注意了到植物中DNA甲基化的作用，并將其描述為一種可以在活躍和非活動(dòng)形式之間切換的新型移動(dòng)元素。現(xiàn)在已知植物中的DNA甲基化發(fā)生在CG、CHG和CHH（其中H可以是A，C或T）的環(huán)境中[4]。這些甲基化堿基在基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用，因此在農(nóng)業(yè)研究和植物育種計(jì)劃中具有越來(lái)越重要的意義。例如，在不同的壓力因素中（如鹽度，缺水和殺蟲(chóng)劑），甲基化顯示出差異性反應(yīng)。與傳統(tǒng)的測(cè)序技術(shù)不同，基于納米孔的測(cè)序允許同時(shí)和直接檢測(cè)DNA甲基化和其他堿基類(lèi)似物以及DNA序列，為所研究的基因組提供更為詳細(xì)的表征[5,6]。

另外，使用傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)序列，大多數(shù)真核基因組測(cè)序項(xiàng)目?jī)H限于結(jié)合每個(gè)染色體拷貝的數(shù)據(jù)來(lái)產(chǎn)生單個(gè)單倍體的共有序列。納米孔技術(shù)提供的長(zhǎng)序列讀長(zhǎng)現(xiàn)在使單倍型分析更加可行——即使對(duì)于多倍體物種也是如此[7,8]。遠(yuǎn)程單倍型分析信息可以提供植物進(jìn)化和馴化的新見(jiàn)解，并可能推動(dòng)和改善未來(lái)作物的生產(chǎn)。

 從實(shí)地到實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的 

不同選擇方案

納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序是Oxford Nanopore Technologies公司研發(fā)的新一代的測(cè)序技術(shù)。其當(dāng)家明星產(chǎn)品MinION是世界上第一款掌上納米孔DNA/RNA測(cè)序儀。它是一款便攜式、實(shí)時(shí)、長(zhǎng)讀長(zhǎng)和低成本的設(shè)備。啟動(dòng)套裝包含測(cè)序試劑和兩張測(cè)序芯片，價(jià)格不到人民幣1萬(wàn)元。MinION由一個(gè)USB接口連接到筆記本電腦上啟動(dòng)，現(xiàn)在還可以使用新開(kāi)發(fā)的MinION伴侶——MinIT，一個(gè)預(yù)配置過(guò)的小型電腦分析儀，省去對(duì)筆記本電腦的需求。

來(lái)自J. Craig Venter研究所的團(tuán)隊(duì)在單個(gè)MinION測(cè)序芯片上，在短短四天內(nèi)以1000美元的成本為模型生物擬南芥（Arabidopsis thaliana）創(chuàng)建了高度連續(xù)的基因組組裝。該組裝顯示出比現(xiàn)有的“金標(biāo)準(zhǔn)”參考基因組更高的連續(xù)性，且基本準(zhǔn)確度相同。該項(xiàng)目的首席研究員托德·邁克爾教授對(duì)此表示，長(zhǎng)讀納米孔組裝揭示了我們?cè)诙套x技術(shù)中看不到的微觀變異[1]。

此外，Oxford Nanopore Technologies還推出了更高通量的臺(tái)式設(shè)備GridION X5和PromethION，以及更袖珍的適合單次使用的Flongle，以適應(yīng)對(duì)不同大小基因組以及更高覆蓋率和樣本量的要求。GridION數(shù)據(jù)產(chǎn)量是MinION的5倍，而高通量、高樣本量的PromethION數(shù)據(jù)產(chǎn)量約為MinION的300倍，可以獨(dú)立或同時(shí)使用48個(gè)測(cè)序芯片，48小時(shí)可產(chǎn)生數(shù)據(jù)15 Tb，可以為如種子銀行或者轉(zhuǎn)基因系之類(lèi)大型或多個(gè)植物基因組項(xiàng)目提供經(jīng)濟(jì)高效的分析。

對(duì)需要調(diào)整不同的文庫(kù)制備參數(shù)，并對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)試的測(cè)序方案往往不可避免的增加實(shí)驗(yàn)成本。在啟動(dòng)大型基因組測(cè)序項(xiàng)目之前，可以使用能夠適配于MinION和GridION設(shè)備的單次測(cè)序芯片F(xiàn)longle（2018年可加入早期用戶(hù)計(jì)劃），進(jìn)行經(jīng)濟(jì)有效的樣品優(yōu)化和質(zhì)量檢查。

 小   結(jié)   

2000年，擬南芥（Arabidopsis thaliana）成為第一個(gè)進(jìn)行基因組測(cè)序和組裝的植物。這項(xiàng)具有里程碑意義的成就耗時(shí)10年才完成，耗資更是高達(dá)1億美元?，F(xiàn)在，使用單個(gè)MinION測(cè)序芯片可以在幾天內(nèi)就完成測(cè)序，成本為1000美元。

與傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)方法相比，長(zhǎng)讀長(zhǎng)納米孔測(cè)序具有許多優(yōu)勢(shì)，使研究人員能夠組裝和探索以前難以處理的植物基因組，為植物進(jìn)化和育種策略提供新的重要見(jiàn)解。這些進(jìn)展對(duì)于經(jīng)濟(jì)有效地應(yīng)對(duì)世界上一些最緊迫的挑戰(zhàn)至關(guān)重要，例如在面臨氣候變化帶來(lái)的農(nóng)業(yè)威脅，抗蟲(chóng)害和依賴(lài)有限數(shù)量的遺傳同質(zhì)作物物種的同時(shí)，可靠地為快速增長(zhǎng)的人口提供食物。（文章來(lái)源：洋蔥頭  測(cè)序中國(guó)）