T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）療法和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細(xì)胞療法是利用患者自身的T淋巴細(xì)胞治療癌癥的兩類前沿基因療法。由于CAR-T細(xì)胞療法進(jìn)來取得的卓越成功，TCR療法的研究相對(duì)不那么引人關(guān)注。但是在治療實(shí)體瘤方面，TCR療法可能比CAR療法更有優(yōu)勢(shì)。

“靶向?qū)嶓w瘤來說，TCRs通往成功的道路可能比CARs要更短一些，”Fred Hutchinson癌癥研究中心的Phil Greenberg博士說。日前，《自然》子刊專門撰文分析了TCR療法在治療實(shí)體瘤方面的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

TCR與CAR療法比較

TCR和CAR療法都對(duì)患者自身的T淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行改造，然后將它們注回患者體內(nèi)殺傷腫瘤的癌癥療法，但是它們識(shí)別抗原的機(jī)制截然不同。TCRs利用α和β肽鏈構(gòu)成的異元二聚體（heterodimer）來識(shí)別由主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）呈現(xiàn)在細(xì)胞表面的多肽片段。而CARs則利用能夠與特定抗原結(jié)合的抗體片段來識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。因?yàn)镸HC分子能夠呈現(xiàn)從細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白中獲得的肽鏈，TCRs與CARs相比，能夠靶向更多種抗原。

理論上講，在治療實(shí)體瘤方面TCRs與CARs相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)。“CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤方面的問題是因?yàn)樗鼈兊陌悬c(diǎn)抗原都是細(xì)胞表面蛋白，”Adaptimmune公司的聯(lián)合創(chuàng)始人Bent Jakobsen博士說。“我不知道是不是存在對(duì)人類癌癥具有特異性的細(xì)胞表面蛋白，”約翰·霍普金斯大學(xué)（Johns Hopkins University）的免疫學(xué)家Jonathan Schneck博士說：“即便CAR-T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的功能卓越，如果沒有合適的靶點(diǎn)我們也無法對(duì)實(shí)體瘤產(chǎn)生真正的影響。”

而TCRs靶向的細(xì)胞內(nèi)蛋白具備腫瘤特異性。這些抗原包括由于腫瘤DNA的隨機(jī)突變?cè)斐傻男驴乖╪eoantigen）和所謂的癌睪丸抗原（cancer testis antigens）。這些抗原通常只在某些腫瘤和生殖系組織（germline tissue）中表達(dá)，而生殖系組織不會(huì)表達(dá)MHC。

而且，表達(dá)TCR的T細(xì)胞通常侵入腫瘤內(nèi)部的能力會(huì)強(qiáng)于CARs，而CARs通常會(huì)附著在腫瘤的外層而不向內(nèi)部滲透。這是因?yàn)镃AR靶向的抗原可能在腫瘤表面有上千個(gè)拷貝，它們會(huì)在CARs滲透到腫瘤內(nèi)部之前就將它們都吸收了。而TCRs在最初碰到腫瘤時(shí)遇到的抗原可能少于50個(gè)拷貝，這讓CARs能夠進(jìn)一步深入腫瘤內(nèi)部與抗原結(jié)合，從而保證更均衡的藥物分布。

TCR療法的起步和挑戰(zhàn)

TCR療法的概念其實(shí)早于CARs產(chǎn)生。1986年，在巴塞爾免疫研究所（Basel Institute for Immunology）工作的Michael Steinmetz博士第一次將一個(gè)T細(xì)胞的TCR基因轉(zhuǎn)移到另一個(gè)T細(xì)胞中，從而賦予第二個(gè)T細(xì)胞相同的抗原特異性。這是當(dāng)今TCR基因療法的祖先。上世紀(jì)末，在美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的Steve Rosenberg博士和Phil Greenberg博士率領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)證明可以通過分離特定TCR賦予T細(xì)胞新的抗原特異性。2004年，Rosenberg博士的團(tuán)隊(duì)啟動(dòng)了第一個(gè)TCR基因療法的臨床試驗(yàn)，接受治療的15名黑色素瘤患者中有兩位的腫瘤達(dá)到完全緩解。這些患者自身的T細(xì)胞在體外得到擴(kuò)增，并且在細(xì)胞中表達(dá)了對(duì)MART-1抗原具有特異性的TCRs。

同時(shí)，克隆TCRs并且將它們整合到病毒載體中使它們?cè)赥細(xì)胞中有效表達(dá)的技術(shù)日漸完善。2008年以來，多個(gè)TCR生物技術(shù)公司開始出現(xiàn)。其中Adaptimmune公司在2008年脫離MediGene成為獨(dú)立公司，Kite Pharma在2009年成立并且隨后與NCI達(dá)成研究協(xié)議。Juno Therapeutics在2013年于西雅圖成立。Kite（如今是Gilead的子公司）和Juno（如今被Celgene收購(gòu)）在開發(fā)TCR療法的同時(shí)也在開發(fā)CAR療法。目前至少有16個(gè)臨床試驗(yàn)正在驗(yàn)證TCR療法在治療實(shí)體瘤方面的療效。

但是在TCR療法的開發(fā)過程中也遭受過嚴(yán)重的挫折。2011年，在NCI進(jìn)行的利用靶向癌睪丸抗原MAGE-A3的TCRs治療實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)中，頭9位患者中有3位患者在接受治療后立即出現(xiàn)嚴(yán)重精神狀態(tài)變化，其中兩位很快昏迷并且去世。與此同時(shí)，賓夕法尼亞大學(xué)（University of Pennsylvania）的Carl June教授的團(tuán)隊(duì)也在使用Adaptimmune公司開發(fā)的靶向MAGE-A3的TCRs。頭兩位接受TCR療法的患者迅速出現(xiàn)心源性休克（cardiogenic shock），在一周內(nèi)去世。

后續(xù)研究表明NCI 的MAGE-A3 TCR意外地能夠與在大腦中的相關(guān)多肽MAGE-A12相結(jié)合。而Adaptimmune公司的TCR能夠與心臟中的肌聯(lián)蛋白（titin）相結(jié)合。肌聯(lián)蛋白被MHC呈現(xiàn)的多肽與MAGE-A3非常相似。

為了防止類似事件的發(fā)生，Adaptimmune公司完全更新了篩查TCR特異性的系統(tǒng)，讓研究人員能夠確定在整個(gè)多肽組（peptidome）中TCR能夠與那些多肽結(jié)合。這會(huì)大幅度提高TCR的安全性。雖然安全性一直是人們關(guān)心的問題，但是在最近的臨床試驗(yàn)中檢驗(yàn)的TCR療法都表現(xiàn)出可以接受的安全性。

權(quán)衡利弊

目前對(duì)TCR療法來說最關(guān)鍵的問題是選擇哪種與腫瘤相關(guān)的抗原作為靶點(diǎn)。它們可以被分為3大類：過度表達(dá)的自身抗原，癌睪丸抗原，和新抗原。每一種類別都有自己的優(yōu)劣，而Juno， Adaptimmune和Kite三家公司也選擇了不同的開發(fā)方向。

Juno公司選擇的是過度表達(dá)的自身抗原。該公司將使用靶向WT1的TCR治療急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia），間皮瘤（mesothelioma）和肺癌，利用靶向間皮素（mesothelin）的TCR治療胰腺癌的臨床試驗(yàn)將在今年開始。WT1和間皮素雖然在有些正常組織中表達(dá)，但是在很多腫瘤中高度表達(dá)。在某些情況下，TCRs可以在攻擊腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞沒有反應(yīng)。因?yàn)橛醒芯勘砻骺梢赃x擇或者改進(jìn)TCRs，讓它們只識(shí)別在腫瘤表面高水平表達(dá)的抗原。表達(dá)這類TCRs的T細(xì)胞應(yīng)該可以安全地殺死腫瘤細(xì)胞。這一策略如果成功，意味著可能有上千種腫瘤過度表達(dá)的蛋白成為靶點(diǎn)。

但是靶向這類抗原同時(shí)也存在著風(fēng)險(xiǎn)，例如，WT1在包括心臟在內(nèi)的幾種關(guān)鍵組織中表達(dá)。間皮素在有些組織的間皮細(xì)胞中也有低水平的表達(dá)，其中包括氣管。所以這些療法有可能帶來對(duì)健康組織的毒性。

因?yàn)檫@個(gè)原因，Adaptimmune公司基本上避免靶向過度表達(dá)的自身抗原。該公司選擇的是癌睪丸抗原，最初的靶點(diǎn)包括MAGE-A10、MAGE-A4、PRAME和NY-ESO-1。這些抗原的特點(diǎn)是它們?cè)诔扇私M織中幾乎不會(huì)被處理成為多肽鏈。癌睪丸抗原的劣勢(shì)一直是表達(dá)這些抗原的癌癥種類較少。因此在癌癥患者中篩選出適合這一療法的患者是一個(gè)非常昂貴和費(fèi)時(shí)的過程。但是在特定的幾種腫瘤患者中，MAGE-A4和PRAME抗原的表達(dá)比例很高，因此在這些腫瘤種類中篩選患者是可行的。

例如NY-ESO-1在滑膜肉瘤（synovial sarcoma）中出現(xiàn)的幾率高達(dá)70%，因此Adaptimmune公司募集這些患者進(jìn)行了一項(xiàng)臨床1/2期試驗(yàn)。在去年六月舉行的ASCO年會(huì)上該公司公布了其中一個(gè)患者群的試驗(yàn)結(jié)果：60%的患者對(duì)TCR療法產(chǎn)生反應(yīng)，其中一名患者達(dá)到完全緩解。預(yù)計(jì)平均總存活期可以達(dá)到159周。

新抗原：個(gè)體化醫(yī)療的可行性

在Juno公司通過謹(jǐn)慎靶向自身抗原來治療常見癌癥，而Adaptimmune的TCR策略將療法安全性放在首位的同時(shí)，NCI的Rosenberg博士和他的團(tuán)隊(duì)以及他們?cè)贙ite Pharma的合作伙伴嘗試在保證安全性的同時(shí)，提高可治療患者的數(shù)量。他們選擇的是個(gè)體化TCR療法的方向。為了達(dá)到這一目標(biāo)，他們靶向的是腫瘤中出現(xiàn)的新抗原，這些抗原由于腫瘤細(xì)胞的DNA突變產(chǎn)生。它的優(yōu)點(diǎn)是幾乎所有癌癥患者都會(huì)產(chǎn)生新抗原，而且這些新抗原都具備腫瘤特異性。“壞消息是由于每個(gè)患者產(chǎn)生的新抗原都不同，這意味著療法需要對(duì)每個(gè)患者進(jìn)行個(gè)體化的優(yōu)化，生產(chǎn)工序?qū)⒆兊梅浅?fù)雜。”Rosenberg博士說。

使用新抗原作為TCR的靶點(diǎn)首先需要發(fā)現(xiàn)這些新抗原，腫瘤細(xì)胞DNA上發(fā)生的突變只有少量能夠?qū)е滦驴乖漠a(chǎn)生，目前沒有很好的算法能夠從DNA序列的變化預(yù)測(cè)新抗原的產(chǎn)生。Rosenberg博士的團(tuán)隊(duì)將攜帶患者腫瘤基因突變的DNA序列表達(dá)在樹突狀細(xì)胞中，然后檢測(cè)哪些序列能夠產(chǎn)生被MHC呈現(xiàn)的含有突變的多肽鏈。同時(shí)檢測(cè)從患者身上收集的T淋巴細(xì)胞能否對(duì)呈現(xiàn)的多肽鏈產(chǎn)生反應(yīng)。如果患者的淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生反應(yīng)，這意味著一個(gè)新抗原被發(fā)現(xiàn)了。研究人員可以收集患者的T淋巴細(xì)胞并且富集對(duì)新抗原有反應(yīng)的淋巴細(xì)胞作為療法。

利用這種方法，Rosenberg博士的團(tuán)隊(duì)成功在一名膽管癌（cholangiocarcinoma）復(fù)發(fā)的患者身上發(fā)現(xiàn)一種新抗原，將針對(duì)這種新抗原的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行富集并且注入患者體內(nèi)導(dǎo)致患者在肺部和肝臟的轉(zhuǎn)移瘤縮小并且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2.5年。他的研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)在結(jié)腸癌、乳腺癌、膽管癌和宮頸癌患者身上獲得過成功。Rosenberg博士的團(tuán)隊(duì)目前使用的是利用對(duì)新抗原反應(yīng)性進(jìn)行富集的T淋巴細(xì)胞，可以預(yù)見的是下一步研究人員將嘗試針對(duì)新抗原的TCRs。TCRs的優(yōu)勢(shì)是它們可以通過人工設(shè)計(jì)產(chǎn)生非常高的親和力。

但是這種個(gè)體化的TCR療法工序能否推廣和擴(kuò)大化是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。使用目前的制造工藝，整個(gè)產(chǎn)生個(gè)體化TCR療法的過程要花費(fèi)大半年的時(shí)間，在這期間患者的癌癥將繼續(xù)惡化。目前限制這一療法的兩大阻礙是TCR克隆和病毒載體的構(gòu)建和驗(yàn)證。TCR克隆過程通常需要6~8周才能完成，而在良好生產(chǎn)規(guī)范（good manufacturing practice， GMP）狀態(tài)下構(gòu)建病毒載體并且對(duì)它進(jìn)行安全性檢測(cè)需要花費(fèi)6個(gè)月的時(shí)間和大約25萬(wàn)美元。“目前這種方法無法進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn)，”Greenberg博士說：“成本實(shí)在太高了。”而且通常一個(gè)基因突變不會(huì)在所有腫瘤細(xì)胞中存在，于是你要對(duì)多個(gè)新抗原做同樣的事。腫瘤異質(zhì)性對(duì)所有TCR療法都是一個(gè)挑戰(zhàn)，但是靶向單個(gè)新抗原可能是一種事倍功半的做法。

Rosenberg博士的團(tuán)隊(duì)在使用機(jī)器人系統(tǒng)力圖用最少的細(xì)胞篩選更多基因突變，從而加快TCR的克隆過程。在構(gòu)建載體方面，病毒載體可能被睡美人轉(zhuǎn)座子（sleeping beauty transposon）系統(tǒng)或CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)取代。位于波士頓的Ziopharm公司的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已經(jīng)被證明可以將靶向新抗原的TCR成功轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞中。這一系統(tǒng)已經(jīng)在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中使用。轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建和擴(kuò)增都在質(zhì)粒DNA中完成，這將大幅度減少與病毒載體相關(guān)的花費(fèi)和監(jiān)管負(fù)擔(dān)。

雖然研究人員承認(rèn)靶向新抗原的個(gè)體化TCR療法目前還不完善。“它還是太慢了，太貴了，”Rosenberg博士的長(zhǎng)期合作者Nick Restifo博士說：“但是它正在變得更快和更便宜。”更多的生物公司也加大對(duì)這一領(lǐng)域的投入。位于麻省劍橋的Neon Therapeutics公司最近與瑞士巴塞爾（Basel）的CRISPR Therapeutics公司達(dá)成合作，共同開發(fā)基于新抗原的T細(xì)胞療法。“我從來沒有想過基于新抗原的TCR療法能夠獲得商業(yè)成功，”June博士說：“但是它將會(huì)發(fā)生。”

打破腫瘤耐受的方法

擁有迅速并且廉價(jià)的靶向新抗原的TCR系統(tǒng)本身并不足以治愈大多數(shù)轉(zhuǎn)移性癌癥。因?yàn)檫@些腫瘤通常會(huì)制造一個(gè)免疫耐受的環(huán)境，讓針對(duì)腫瘤的T細(xì)胞無法被正常激活。“最終我們需要的不單是靶向單個(gè)新抗原，而是同時(shí)帶來更廣泛的免疫反應(yīng)，”Jakobsen博士說：“這樣你才能打破對(duì)腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。這是讓免疫系統(tǒng)重新獲得控制權(quán)的方法。”

目前的免疫療法很少能夠達(dá)到這一目標(biāo)?，F(xiàn)有的TCR療法在縮小腫瘤和啟動(dòng)免疫反應(yīng)方面能夠起到一些作用，但是關(guān)鍵是找到某些能夠激發(fā)對(duì)腫瘤的多克隆免疫反應(yīng)的方法。將TCRs與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用可以達(dá)到這一目標(biāo)，但是如PD-1阻斷劑一類的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在攜帶高基因突變負(fù)擔(dān)的腫瘤中效果最好，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中卻很少能夠起作用。

其它方法包括在TCRs中引入共受體（co-receptor）。“基本上所有在CARs中做過的改進(jìn)方法你都可以想像在TCRs中進(jìn)行，”伊利諾伊大學(xué)（University of Illinois）的免疫學(xué)家David Kranz博士說。另外一種方法是將TCR細(xì)胞療法與激活干擾素基因的激動(dòng)劑一起使用。

而最明顯的激活多克隆腫瘤免疫反應(yīng)的方法是通過CD4 輔助性T細(xì)胞（helper T cells）。CD4細(xì)胞能夠增強(qiáng)抗原呈現(xiàn)并且通過多種機(jī)制加強(qiáng)CD8效應(yīng)T細(xì)胞的功能。比如CD4細(xì)胞可以分泌干擾素γ，它能夠?qū)е乱活惡投怣HC分子的表達(dá)并且在樹突狀細(xì)胞中提高抗原呈現(xiàn)機(jī)制中其它成份的表達(dá)。Kranz博士認(rèn)為在CD4細(xì)胞中使用TCR將是下一個(gè)重要研究方向。

“這是產(chǎn)生更多CD8和CD4細(xì)胞，讓它們識(shí)別除了你靶向的抗原以外的其它抗原的最好刺激方法，”Jakobsen博士說。癌癥免疫學(xué)家認(rèn)為這種抗原表位擴(kuò)展（epitope spreading）的效應(yīng)是消滅實(shí)體瘤的關(guān)鍵。

CARs和TCRs的未來

一種能夠同時(shí)幫助CARs和TCRs療法的技術(shù)是Cell Design Labs公司的合成Notch受體（Synthetic Notch Receptor，SynNotch）技術(shù)。這種技術(shù)能夠在細(xì)胞中建立一個(gè)能夠感知組織特異性的SynNotch。它相當(dāng)于一個(gè)開關(guān)，讓表達(dá)在T細(xì)胞表面的TCRs或CARs只有在特定組織中才會(huì)被激活。SynNotch能夠幫助CARs克服在治療實(shí)體瘤方面的最大挑戰(zhàn)，那就是沒有足夠特異性的腫瘤抗原。

June教授認(rèn)為CAR和TCR療法最終都將對(duì)實(shí)體瘤產(chǎn)生作用。而且CARs和TCRs應(yīng)該合并成為組合療法，因?yàn)槟[瘤對(duì)這兩種療法產(chǎn)生抗性的方法截然不同。腫瘤通過丟失MHC來逃避TCRs，而對(duì)CAR-T細(xì)胞的逃逸是通過丟失靶向抗原來完成。腫瘤細(xì)胞不太可能同時(shí)產(chǎn)生兩種抗性，因此CAR-TCR組合療法能夠消滅它們。“因?yàn)槿祟悓?shí)體瘤的克隆復(fù)雜性，我認(rèn)為只用一種細(xì)胞，一個(gè)CAR或者一個(gè)TCR就能成功是不現(xiàn)實(shí)的，”June博士說：“一旦你認(rèn)可了使用細(xì)胞療法來治療患者，那么生產(chǎn)一個(gè)同時(shí)包括CAR和TCR的產(chǎn)品的成本并不會(huì)增加多少。”

去年9月，葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）公司斥資6100萬(wàn)美元從Adaptimmune公司買入了一個(gè)TCR基因療法項(xiàng)目。這個(gè)信號(hào)表明大量涌入CARs的投資也惠及TCRs。不過在TCRs領(lǐng)域的一個(gè)明確的臨床成功將對(duì)這一領(lǐng)域的投入產(chǎn)生很大幫助。“現(xiàn)在很多公司都在等待看到概念驗(yàn)證上的成功才會(huì)跟進(jìn)，”Greenberg博士說。不過那些在TCR領(lǐng)域孤獨(dú)地工作了數(shù)十年的核心科學(xué)家們終于很高興地看到，這項(xiàng)技術(shù)成為治療癌癥的主流之一并且在經(jīng)歷爆炸性的發(fā)展。(生物谷Bioon.com）